小鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)elisa試劑盒產(chǎn)品說明書產(chǎn)品說明書
小鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)elisa試劑盒實(shí)驗(yàn)原理
小鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被小鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗體,經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP-4)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。
樣本處理及要求
1. 血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2. 血漿:用EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測(cè)量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測(cè)。
4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:請(qǐng)1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測(cè),或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注:標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
需要而未提供的試劑盒器材
1.酶標(biāo)儀(450nm)
2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3.37℃恒溫箱
4.蒸餾水或去離子水
名稱 | 96孔配置 | 48孔配置 | 備注 |
微孔酶標(biāo)板 | 8孔×12條 | 8孔×6條 | 無 |
標(biāo)準(zhǔn)品 | 0.3mL*6管 | 0.3mL*6管 | 無 |
樣本稀釋液 | 6mL | 3mL | 無 |
檢測(cè)抗體-HRP | 10mL | 5mL | 無 |
20×洗滌緩沖液 | 25mL | 15mL | 按說明書進(jìn)行稀釋 |
底物A | 6mL | 3mL | 無 |
底物B | 6mL | 3mL | 無 |
終止液 | 6mL | 3mL | 無 |
封板膜 | 2張 | 2張 | 無 |
說明書 | 1份 | 1份 | 無 |
自封袋 | 1個(gè) | 1個(gè) | 無 |
備注:
1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為:詳見說明書;
2、經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測(cè)范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
1、嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
2、洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
3、消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。
4、底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
5、避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
6、在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
7、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
8、任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
9、不能使用過期產(chǎn)品。
10、如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置。
試劑準(zhǔn)備
試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
20×洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按1:20稀釋,即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。
操作步驟
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;
3.樣本孔中加入待測(cè)樣本50μL;空白孔不加。
4. 除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液(350μL),靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到直線回歸方程,將樣品的OD值代入方程,計(jì)算出樣品的濃度。
試劑盒性能
1、檢測(cè)范圍:詳見產(chǎn)品說明書。
2、靈敏度:詳情見說明書。
3、特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
4、重復(fù)性:板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ,板間變異系數(shù)小于15% 。